Fluoreszcenciamikroszkóp

A fluoreszcenciamikroszkóp egy olyan fénymikroszkóp, ami a mintáknak a fény által kiváltott emisszióját, fluoreszcenciáját képezi le. A minta elemeinek szelektív megfigyelésével jobb minőségű képek készíthetők. A fluoreszcencia jelenségét is kihasználó mikroszkópia kombinálható a konfokális pásztázó mikroszkóp módszerével, és megtalálható sok mai modern mikroszkópiai eljárásban is. A stimulált emisszió kioltás (Stimulated Emission Depletion, STED) révén pedig megvalósulhatott a szuperfelbontású mikroszkópia, aminek kidolgozásáért Stefan Hell, Eric Betzig és William Moerner 2014-ben kémiai Nobel-díjat kapott.

Digitális kamerával ellátott fluoreszcenciamikroszkóp

Működése

A fluoreszcencia felhasználása a mikroszkópos vizsgálatokban azon alapul, hogy a legtöbb szerves vegyület – így például számos sejtkomponens, A-, B-, C-vitamin, aminosavak – ultraibolya vagy látható fénnyel megvilágítva a kémiai szerkezetére jellemző tulajdonságú látható fényt bocsát ki. A különböző vegyületek rendszerint más és más színben világítanak, s így a kémiai összetételükben különböző sejtek vagy alkotórészek a metszetben fluoreszcencia kibocsátásuk alapján jól megkülönböztethetők. Ezen az úgynevezett saját fluoreszcencián kívül fluoreszcens festéket – fluoroforokat – is lehet alkalmazni. A klasszikus mikrotechnikai festési eljárásokkal szemben, a fluoreszcenciamikroszkóp alkalmazásakor nagy előny – mind a belső, mind a külső fluoreszcencia megfigyelése esetén – hogy a vizsgálandó szövetet megkíméli a fixálás és a festés durva kémiai hatásaitól, elkerülhető az élő szövet elváltozása. Az eljárás előnye még az is, hogy a metszet a mintavételezés után néhány órán belül már vizsgálható. Szövetek vizsgálatán kívül felhasználják a módszert saválló baktériumok kimutatására is.

A leképezés sémája a fluoreszcenciamikroszkópban

Dikroikus szűrők

Felépítés

A fluoreszcenciamikroszkópban a széles sávú fényforrás fényéből egy színszűrő választja ki a gerjesztéshez optimális hullámhosszú komponenseket. A dikroikus tükör ezt a hullámhosszú fényt visszaveri, ami az objektíven keresztül a mintára jut. A mintában elnyelődő, gerjesztő fény által kiváltott fluoreszcens fényt az objektív gyűjti össze, ami utána az előbbi dikroikus tükrön keresztül jut a detektorra.

A dikroikus tükör (vagy szűrő) egy olyan speciális optikai elem, ami az egyik hullámhosszú fényt tükörként visszaveri, a másikat átengedi. Az átlátszó lemezre párologtatott vékony fémoxid rétegben az interferencia jelensége miatt az egyik hullámhosszú fénykomponensre kioltás, a másikra erősítés történik. A réteg vastagságával és anyagának törésmutatójával tervezhetők a kiválasztani kívánt hullámhosszak. A dikroikus szűrő azt is megakadályozza, hogy a sokkal nagyobb intenzitású gerjesztő fény a megfigyelőtérbe jusson. Ezzel és a detektor elé helyezett emissziós oldali szűrővel a viszonylag gyenge emisszió esetén is jó kontrasztos kép készíthető.

Megvilágítás

Megvilágításra korábban higanygőzlámpát vagy fémelektródokkal működő ívlámpát használtak, de manapság egyre inkább lézereket. Mivel az időben folytonos lézerek egyszínű fényt bocsátanak ki, ebben az esetben nincs szükség a gerjesztő oldalon szűrőre. A ma már rendelkezésre álló kisméretű, olcsó diódalézerek a gerjesztő hullámhosszak tekintetében széles választékban állnak rendelkezésre. Jól fókuszálható, 300-1000 nm közötti hullámhosszú, kényelmesen használható fényforrások.

Fluoreszcens festékek

Az esetek nagy részében a natív fluoreszcenciát inkább kerülni kell. Ráadásul a szelektív jelölés, és ezzel szelektív megfigyelés előnye, hogy kiválaszthatóvá teszi a mintának a vizsgálat szempontjából fontos elemeit, például a tumoros sejteket. Korábban leginkább az ultraibolya fénnyel gerjeszthető festékek álltak rendelkezésre, ma már széles választékban találunk a látható fényre fluoreszkáló fluoroforokat, így az egyszerűbb eszközökben elkerülhető a drágább kvarcból készült optikai elemek, lencsék használata. A jelölésre használt festékek például az akridin narancs, illetve a fluoreszcein és származékai.

Fluoreszcenciamikroszkóppal készült felvételek

• 
  Candida a vizeletben
• 
  Rozsdagomba spórái akridin narancs festéssel
• 
  Mikroszkópos felvétel a papír saját fluoreszcenciájáról
• 
  HeLa sejtek különböző színű fluoroforokkal festett képe
• 
  Szuper felbontású mikroszkópban és fluoreszcenciával kombinált konfokális mikroszkópban készült felvételek összehasonlítása
• 
  Fluoreszcencia- és szuperfelbontású mikroszkópos felvétel tumoros sejtekről

Források

• Pozsgai Imre: A fluoreszcens mikroszkópia hagyományos és szuperfelbontású módszereinek alapjai, Typotex 2020, ISBN 978 963 493 072 3