Vizsgálati anyagok előkészítése pásztázó elektronmikroszkópos vizsgálatokhoz

A pásztázó elektronmikroszkópos (PEM) vizsgálatokat mind kiterjedtebben használják az orvosbiológiai kutatásokban, a diagnosztikában és a törvényszéki orvostanban. Nagyon jól vizsgálhatók vele sejttenyészetek, kémiailag fixált sejtszuszpenziók, természetes felszínek, mint a bőr és nyálkahártyák, és az anyagok törésével, vagy más módon olyan mesterséges felszínek készíthetők, amelyek a belső szerkezetet teszik láthatóvá. Jól detektálhatók és szemléltethetők vele pl. a vér sejtjeinek kóros alaki eltérései, a falósejtek mozgásainak fázisai, a nyálkahártyák felszínének kóros rendellenességei, haj, szőr, köröm elváltozásai stb. A biológiai vizsgálati anyagok előkészítése a pásztázó elektronmikroszkópos vizsgálatokhoz azonban sajátos módszereket követel.

Csillók pásztázó elektronmikroszkópos képe.

Anyagkivétel és fixálás

Az orvosbiológia vizsgálatoknál szóba jövő anyagtípusok közül csak néhány készíthető elő kémiai rögzítővel való kezelés (fixálás) nélkül. Ilyenek a szőr, a köröm, a fogzománc, valamint a mésztartalmú szövetek (csont, dentin) szerves komponensektől megtisztított, mineralizált (elmeszesedett) alapállománya. A vizsgálni kívánt lágy szöveteket fixálni kell. Erre a legáltalánosabban az elektronmikroszkópos technikákban jól bevált, a finomszerkezet megőrzésére alkalmas aldehid-ozmium kettős fixálás használatos. Bizonyos fokig eltérést jelent az, hogy a felszínvizsgálatoknál nem a belső szerkezet megőrzése, hanem a zavaró szennyezésektől mentes felszín nyerése az alapvető cél. Alapvető fontosságú ezért a vizsgálni kívánt felszín gondos letisztítása a fixálóba merítés előtt. Ugyancsak ilyen fontos, hogy a fixálás illetve a további előkészítés során a felszín szennyeződés- és sérülésmentes maradjon. Általában ugyancsak előnyösebb PEM-os vizsgálatokhoz a szokásosnál hosszabb, a szövet keménységét jobban fokozó fixálást alkalmazni, és esetenként még jobb eredmény érhető el speciális, az anyagot merevítő hatású impregnálási eljárásokkal.

Szárítás

A vákuumtérben történő vizsgálathoz az anyagokat szárítani kell. Az általában folyékony nitrogénnel lehűtött tárgyasztalokra helyezett fagyasztott, de kémiailag nem módosított minták vizsgálata analítikai célokra használható, a morfológiai felbontóképesség az ilyen mintákon igen szerény, és csak az analizálandó terület kiválasztására szolgál. A szárítás a lágy szövetek esetében igen kritikus eljárás a szerkezet megtartása szempontjából. A sejtek, szövetek finomszerkezetének fenntartásában a hidrofób és hidrofil csoportok kölcsönhatásainak igen nagy szerepe van, és ez az érzékeny egyensúlyi állapot a víz eltávolításával megbomlik. A víztelenítés szerkezetkárosító hatása a fénymikroszkópos (FM-os) és a transzmissziós elektronmikroszkópos (TEM-os) vizsgálatra kerülő metszet-minták előkészítése során a mintákat kémiai kötésekkel stabilizáló fixálással, az ezt követő fokozatos víztelenítéssel, majd paraffinba illetve műgyantába történő beágyazással – gondos kivitelezés mellett – lényegében elhanyagolhatóra csökkenthetők. A lágy szövetek szárítása közben azonban a folyadék és a gőzfázis felszínhatára az anyag szerkezeti elemein áthalad, ami az igen erős felületi feszültségi effektusok következtében molekuláris átrendeződéseket okoz. A végeredmény a szövet zsugorodása és torzulása. Ezek a nemkívánatos hatások gyakorlatilag elhanyagolhatóra csökkenthetők a megfelelő fixáló szerekkel végzett erőteljes („merevítő”) kezeléssel, esetleg valamilyen impregnációs módszerrel, valamint olyan szárítási módszerekkel, amelyek a felületi feszültség hatását csökkentik, vagy kiküszöbölik.

Volatilis szárítás

A szárítás közben fellépő felületi feszültségi hatás a víznél a legerősebb, így a zsugorodás tovább csökkenthető kisebb felületi feszültségű, gyorsan párolgó (volatilis) folyadékokból történő szárítással. Ehhez az anyagot fokozatosan – megfelelő köztes keverékeken át – a szárításra használt folyadékba (pl. éter, amilacetát, propilén-oxid stb.) kell átvinni, és ebből kiszárítani. A módszer megfelelő eredményt ad vékony rétegvastagságú vagy kisméretű minták esetében.

Fagyasztva szárítás

Ez azzal küszöböli ki a szerkezetváltozásokat, hogy a jég vákuum-szublimáltatásával a felszínhatáron jelentkező felületi feszültségi hatásokat kiiktatja. Itt azonban egy másik probléma jelent hátrányt; nevezetesen az, hogy a lefagyasztás közben képződő jégkristályok károsítják az anyag szerkezetét. Ez a jelenség csökkenthető, ha a fagyasztva szárítás valamilyen apoláris oldószerből (alkohol, amilacetát, butanol) történik. Ez azonban már eléggé megbonyolítja, eszköz- és munkaigényessé teszi az eljárást.

Kritikus ponton szárítás

A kritikus pont a folyadékoknak és telített gőzeiknek azt a hőmérsékleti és nyomásértékét jelenti, amelyen a folyadék és telített gőzeinek sűrűsége azonos, így a két fázis közötti határfelszín eltűnik. A kritikus ponthoz tartozó hőmérséklet a kritikus hőmérséklet, e fölött az anyag csak gázhalmazállapotban létezik, semmilyen nagy nyomáson sem cseppfolyósítható. Ha egy folyadékot zárt térben kritikus hőmérséklete fölé melegítünk, a kritikus ponton átlépve a folyadék halmazállapottal azonos sűrűségű gázhalmazállapot jön létre. Eközben a folyadék úgy alakul gázzá, hogy fázishatár nem jelentkezik: a folyadékban lévő folyadékkal átitatott anyag gázzal átitatottá válik, azaz megszárad anélkül, hogy a folyadék-gőz fázishatár áthaladásával járó felületi feszültségi hatások jelentkeznének. Az eljárás gyakorlati kivitelezése szempontjából fontos az, hogy olyan anyagokból történjen a szárítás, amelyeknek kritikus pontjához nem túl magas hőmérséklet és nyomás tartozik, hogy az anyag ne károsodjon, és a művelet laboratóriumi körülmények között viszonylag könnyen kivitelezhető legyen. Erre a vizes közeg a víz igen magas kritikus hőmérséklete és nyomása (+344 °C; 217,7 atm) miatt nem alkalmas. A gyakorlatban a szén-dioxidos eljárás vált be. (Használtak ugyan Freon-13-at is, ma azonban ez környezetvédelmi okokból nem jöhet szóba.)

A minta vezetőképességének és anyagi homogenitásának javítása

Ahhoz, hogy a felszín topográfiáját pontosan tükröző képeket kapjunk, alapvetően fontos, hogy a primer sugár beesési szögén kívül más ne modulálja számottevően a kilépő szekunder elektronok mennyiségét. A szekunder elektronok kilépését elősegíti az a feszültségkülönbség, amelyet a tárgy és a jelfogó (detektor) között alkalmaznak szekunder elektronok összegyűjtésére. A detektor feszültsége a tárgyhoz képest pozitív, ezért vonzó, kivonó hatása érvényesül a tárgy elektronjaira, amely ideális esetben a tárgy valamennyi pontjára nézve egyforma. Megváltozik azonban a helyzet, ha a tárgy felszínén a töltéseloszlás nem egyenletes. A felszín negatívabb töltésű részletei és a detektor között nagyobb lesz az elektronok kilépését elősegítő feszültségkülönbség, így ezekről a területekről az elektronemisszió – a felszíni topográfiától és a primer sugár beesési szögétől függetlenül – nagyobb lesz, azaz a képen világosabb területként jelenik meg. Ennek kialakulására nagyobb a lehetőség a rossz vezetőképességű anyagokon, mivel a primer elektronsugár egy részének elnyelődése negatív töltések bevitelét jelenti, és ha ezek azonnali elvezetése nem biztosított, a tárgyfelszínen negatívan feltöltődött területek jönnek létre. Ez az adott területen aránytalanul erős és időben is elhúzódó elektronkibocsátást vált ki, ezért az ilyen terület a képernyőn fénylik, illetve belőle kiindulva a pásztázósugár mozgásának irányában a képen világos sávok jelentkeznek. Ez az úgynevezett feltöltődési műtermék, és ha a tárgy több területén is fellép, az egész képet ködössé, homályossá, teljesen értékelhetetlenné teszi. A minta feltöltődése nem jöhet létre, ha anyaga, illetve maga a felszín jó vezető, mert ilyenkor az elnyelt töltésmennyiség azonnali elvezetése biztosított. A kiszárított biológiai minták általában igen rossz elektromos vezetők, ezért vezetőképességüket a PEM-os vizsgálatokhoz jelentős mértékben növelni kell. A legáltalánosabban használt módszer ehhez a felszínnek egy vékony, egyenletes, jól vezető fémréteggel történő bevonása. Ez történhet vákuum-gőzöléssel, vagy katódporlasztással. Ehhez általánosan használt fém az arany, de szebb képeket kapunk, ha a felszínt arany-palládium megközelítőleg 1:1 arányú ötvözetével vonjuk be.

Források

• Anderson T. F.: Techniques for the preservation of three-dimensional structure in preparing speciemns for the electron microscope. Trans. N. Y. Acad. Sci. Ser. II. 13, 130 (1951)
• Boyde A. – Wood C.: Preparation of animal tissues for surface-scanning electron microscopy. J. Microscopy 90, 221 (1969)
• Laczkó J. – Lévai G. – Varga S. – Gyarmati J. jr.: Preparation of the tibial growth organ of young rats for scanning electron microscopy. Mikroskopie 31, 57 (1975)
• Laczkó J. – Varga S.: Experiences with the thiocarbazide-mediated osmium binding in coating biological specimens for scanning electron microscopy. Microskopie 32, 69 (1976)
• Laczkó J. – Varga S.: Orvosbiológiai kutatásokban alkalmazható pásztázó (scanning) elektronmikroszkópos vizsgálómódszerek. A Biológia Aktuális Problémái (Ed.: Csaba Gy.) 15, 121 (Medicina Kiadó 1979) ISBN 963-240-647-8
• Schaff Zs. - Kertes I. - Lapis K. Nagy G. - Csikós A.: Human bronchus nyálkahártya scanning elektronmikroszkópos vizsgálata ép és kóros körülmények között. Morph. és Igazságügyi Orv. Szemle 15, 249 (1975)
• Sótonyi P.: Scanning elektronmikroszkóp alkalmazásának lehetőségei az igazságügyi orvostan gyakorlatában. Morph. és Igazságügyi Orv. Szemle 16, 93 (1976)
• Varga S. – Laczkó J.: Tapasztalataink házi készítésű kritikus ponton szárító berendezéssel. Kísérletes Orvostudomány 29, 361 (1977)